Đầu năm 1861, Pháp tấn công Gia Định lần thứ hai, Quản Định đưa quân đồn điền của mình phối hợp với binh của Nguyễn Tri Phương phòng giữ chiến tuyến Kỳ Hòa. Đại đồn thất thủ, ông lui về Gò Công, hợp cùng Lưu Tiến Thiện, Lê Quang Quyền chiêu binh ứng nghĩa, trấn giữ được vùng Gia Định - Định Tường, được triều đình phong làm Phó lãnh binh. Trương Định tổ chức lực lượng, triển khai kế hoạch tác chiến cả vùng Gò Công, Tân An, Mỹ Tho, Chợ Lớn, Sài Gòn, Đồng Tháp Mười kéo dài đến biên giới Cao Miên (Campuchia).